Makalah Kimia Analitik 2

“Metode Pemisahan Eugenol Dari Minyak 

Cengkeh Dan Penentuan Kadarnya Secara 

Kromatografi Gas”  

BAB I

PENDAHULUAN

Indonesia merupakan negara yang kaya dengan sumber daya alam, baik flora maupun fauna. Sumber daya alam ini merupakan salah satu faktor pendukung dan penggerak dalam pembangunan bangsa Indonesia. Di Indonesia dikenal beberapa flora penghasil minyak atsiri yang salah satunya adalah berasal dari tanaman cengkeh (Syzygium aromaticum L.) famili dari Myrtaceae. Minyak cengkeh merupakan minyak atsiri yang diperoleh dari tanaman cengkeh Kandungan minyak cengkeh pada bagian tanaman tersebut bervariasi jumlahnya. Bunga mengandung sekitar 20% minyak, sedangkan bagian gagang dan daun sekitar 4-6% minyak Minyak atsiri dalam bunga dan gagang cengkeh mengandung eugenol dan kariofilen, yang merupakan komponen kimia yang memberikan rasa getir dan bau pedas dari cengkeh.

Sebagai negara berkembang yang banyak menghasilkan berbagai produk parfum dan sabun melalui industri, membutuhkan banyak bahan dasar sebagai campuran dalam pembuatan produk-produk ini. Oleh karena itu untuk ketersediaan bahan dasar dalam negeri, maka perlu dicari alternatif lain dengan memanfaatkan cengkeh sebagai salah satu hasil alam Indonesia yang sangat melimpah. Salah satu jalur yang dapat ditempuh adalah memanfaatkan eugenol dari minyak cengkeh yang nantinya akan diolah lagi menjadi euginil asetat atau eugenil metil eter dan eugenil etil eter yang digunakan sebagai komposi parfum.

Eugenol merupakan persenyawaan kimia yang paling penting di dalam minyak cengkeh dan jumlahnya dapat mencapai 83-95%. Eugenol dapat diisolasi dari minyak dengan menambahkan NaOH atau KOH 3%, sehingga menghasilkan natrium atau kalium eugenolat.

Metode pemisahan dan penentuan kadar senyawa eugenol dapat diketahui secara kromatografi gas. Berdasarkan grafik yang terlihat pada sistem pengendalian data pada kromatografi gas, terlihat pemisahan komponen-komponen penyusun minyak cengkeh dan kadar tiap-tiap komponen.

Dalam makalah ini terdapat hasil penelitian kadar eugenol dalam minyak cengkeh yang dikutip dari jurnal Jance Lumanaf Manopo yang berjudul “Isolasi Eugenol dari Bunga Cengkeh dan Sintesis Eugenil Asetat” dari  http://molucasablog.blogspot.com/2008/ 10/isolasi-eugenol-dari-bunga-cengkeh.html

BAB II

PEMBAHASAN

2.1. TANAMAN CENGKEH

Tanaman cengkeh (Syzygium aromaticum), termasuk dalam family Myrtaceae. Daunnya bundar telur sungsang, dan daun yang masih muda berwarna merah jambu kekuning-kuningan, buahnya berupa buni, berbentuk lonjong, dan berwarna merah tua (Gambar 1).

 

Cengkeh merupakan tanaman tropis berakar tunggang, bercabang dan kuat. Tinggi tanaman dapat mencapai 15 meter dan dapat mencapai umur sampai lebih dari 100 tahun, mempunyai daun berbentuk lonjong yang berbunga pada pucuk-pucuknya. Tangkai buah pada awalnya berwarna hijau, dan berwarna merah jika bunga sudah mekar. Cengkeh akan dipanen jika sudah mencapai panjang 1,5 - 2 cm (Anonim, 2002).Tanaman cengkeh memiliki kandungan minyak atsiri yang cukup tinggi. Setiap bagian pohon mengandung minyak, mulai dari bunga, daun, gagang hingga akar. Kandungan minyak cengkeh pada tanaman cengkeh bervariasi jumlahnya, namun yang tertinggi terdapat pada bagian bunga yaitu sekitar 14 – 21%, sedangkan pada gagang cengkeh yaitu sekitar 5 – 6% (Guenther, 1987).Semua bagian dari tanaman cengkeh mempunyai kandungan yang relatif sama, yang berbeda hanya jumlahnya saja. Di bawah ini Tabel yang menunjukkan sifat atau karakteristik dari minyak gagang cengkeh.

2.2. MINYAK CENGKEH

2.2.1. Komposisi Kimia

Minyak cengkeh merupakan minyak atsiri yang diperoleh dari tanaman cengkeh (Syzygium aromaticum). Minyak atsiri ini dapat diperoleh dari bunga, gagang, dan daun tanaman cengkeh. Kualitas minyaknya dievaluasi dari kandungan fenol, terutama eugenol. Kadar eugenol dalam minyak cengkeh dipengaruhi oleh asal minyaknya. Kadar terbanyak dan kualitas yang baik dapat dihasilkan oleh minyak yang diperoleh dari bunga dan gagang cengkeh. Kualitas minyak daun cengkeh hanya sedikit lebih rendah dibandingkan dengan minyak bunga atau gagang cengkeh (Aksan, 2007). Perbandingan kadar eugenol dalam minyak cengkeh berdasarkan asalnya, tersaji pada Tabel 3.

Kandungan minyak cengkeh pada bagian tanaman tersebut bervariasi jumlahnya. Bunga mengandung sekitar 20% minyak, sedangkan bagian gagang dan daun sekitar 4-6% minyak (Guenther, 1990). Selain itu, kandungan minyak saat ekstraksi dipengaruhi oleh lamanya proses penyulingan (Zulchi dan Aisni, 2002).Minyak atsiri dalam bunga dan gagang cengkeh mengandung eugenol dan kariofilen, yang merupakan komponen kimia yang memberikan rasa getir dan bau pedas dari cengkeh. Di bawah ini merupakan Tabel perbandingan komposisi kimia bunga dan gagang cengkeh.

Pada umumnya minyak cengkeh terdiri dari campuran berbagai persenyawaan kimia, yaitu:

a. Eugenol [CH₂=CHCH₂C₆H₃(OCH₃)OH)]

Eugenol merupakan persenyawaan kimia yang paling penting di dalam minyak cengkeh dan jumlahnya dapat mencapai 83-95%. Eugenol bersifat mudah menguap, tidak berwarna atau berwarna agak kuning dan mempunyai rasa getir (Guenther, 1990).

Eugenol dapat diisolasi dari minyak dengan menambahkan NaOH atau KOH 3%, sehingga menghasilkan natrium atau kalium eugenolat (Anonim, 2006). Gambar di bawah ini menggambarkan reaksi antara eugenol dan penambahan NaOH, sehingga menghasilkan natrium eugenolat (Gambar 2).

Eugenol digunakan sebagai bahan baku parfum, pemberi flavor, dan dalam bidang pengobatan sebagai antiseptik dan anestesi. Eugenol juga digunakan pada pembuatan isoeugenol untuk memproduksi vanilin sintetis. Saat ini, kebanyakan vanilin sintetis dibuat dari fenol atau dari lignin (Anonim, 2002).

b.Eugenol asetat [CH₃CH=CHC₆H₃(OCH₃)COOCH₃]

Eugenol asetat terdapat juga pada minyak gagang cengkeh, tetapi dalam jumlah yang sangat kecil. Eugenol asetat dapat dibuat dari eugenol dengan cara asetilasi eugenol, menggunakan asetat anhidrit.

c.Kariofilen (Caryophyllene) C₁₅H₂₄

Di dalam minyak cengkeh terdapat alpha dan betha kariofilen dengan jumlah 5-12%. Kariofilen dapat dipisahkan dari minyak dengan menambahkan larutan soda 70%, kemudian diekstraksi dengan ester. Selanjutnya, diuapkan di atas penagas air.

d.Metil n-amil keton

Senyawa dalam minyak daun cengkeh yang terdapat dalam jumlah yang sangat sedikit, dan merupakan senyawa yang menimbulkan bau khas minyak daun cengkeh.

2.2.2. Mutu Minyak Cengkeh (Clove Steam Oil)

Mutu minyak cengkeh, ditentukan oleh kadar eugenol. Kadar eugenol dalam minyak gagang cengkeh ditentukan oleh kondisi gagang sebelum disuling (dirajang atau tanpa rajang) dan metode penyulingan (Ketaren, 1985).Di Indonesia belum ada suatu standar mutu yang pasti untuk minyak gagang cengkeh. Di bawah ini Tabel standar mutu dari minyak gagang cengkeh menurut Essensial Oil Association of USA (EOA).

Faktor-faktor yang mempengaruhi mutu minyak sangat ditentukan oleh sifat dan senyawa kimia yang terkandung di dalamnya. Sifat fisik seperti bobot jenis, indeks bias, putaran optik, dan kelarutan dalam etanol 70% dapat dijadikan kriteria untuk menentukan kemurnian minyak

Apabila bobot jenis, indeks bias, dan putaran optik menunjukkan angka yang tertinggi, kemungkinan minyak cengkeh tersebut mengandung bahan-bahan lain seperti mineral dan lemak. Apabila sifat itu menunjukkan angka yang rendah, maka kemungkinan minyak tersebut mempunyai kadar eugenol yang rendah (Rusli dkk., 1979).

2.2.3. Manfaat

Minyak cengkeh ternyata punya khasiat yang cukup besar dan merupakan baku industri farmasi dan pestisida nabati. Hasil penelitian Balai Penelitian Tanaman Obat dan Rempah (BALITTRO) menunjukan bahwa, minyak cengkeh juga dapat dipakai sebagai bahan baku pembuatan balsam yang dapat menghilangkan rasa sakit, terutama reumatik. Di samping itu dapat digunakan juga sebagai obat kumur dan permen.Bukan itu saja, hasil penelitian BALITTRO juga menunjukkan eugenol yang terdapat dalam minyak cengkeh ternyata dapat mengendalikan jamur patogen pada tanaman. Contohnya, jamur Fusarium oxysporum yang menyebabkan penyakit busuk batang pada tanaman vanili dan jamur tular tanah yang umumnya menjadi penghambat produksi tanaman hortikultura dan perkebunan.

2.2. SINTESIS EUGENOL

Prinsip:

Kadar eugenol dapat diketahui dengan penambahan KOH atau NaOH dimana eugenol bereaksi dengan NaOH menjadi natrium eugenolat. Dari sisa minyak yang tak bereaksi, kadar eugenol dapat diketahui.

Prosedur kerja:

1.Mengisi labu cassia dengan KOH 4% sebanyak ± 80 ml.

2.Menambahkan ± 10 ml minyak cengkeh ke dalamnya.

3.Mengocok dengan shaker selama 30 menit.

4.Menambahkan NaOH sebanyak ± 4ml.

5.Mengocok labu, sehingga gelembung didalam labu tersebut naik.

6.Menutup dan mendiamkannya semalam.

7.Mengamati dan mencatat nilai yang terdapat pada labu.

Hasil:

Nilai yang tertera pada labu cassia yaitu 0,8 ml.

Perhitungan:

Kandungan eugenol pada minyak gagang cengkeh dihitung menggunakan rumus:

 

Keterangan:

10  = Volume minyak yang diukur.

0,8 = Nilai yang didapat dari pembacaan pada labu cassia.

Jadi, kadar eugenol minyak gagang cengkeh ini yaitu:

Pembahasan:

Uji eugenol ini bertujuan untuk menentukan kadar eugenol dalam minyak gagang cengkeh yang diuji. Dari hasil pengujian, kadar eugenol yang didapat yaitu sebesar 92%. Nilai tersebut telah sesuai dengan standar mutu yang ditetapkan EOA yaitu sebesar 89% sampai 95%. Semakin tinggi kadar eugenol dalam minyak gagang cengkeh, maka mutu minyak atsiri akan semakin baik (Ketaren, 1985).

Kesimpulan:

Kadar eugenol minyak gagang cengkeh yang didapat yaitu sebesar 92%. Berdasarkan standar mutu minyak gagang cengkeh dari EOA, nilai tersebut telah sesuai dengan standar dari EOA yaitu sebesar 89% sampai 95%.

2.2. PEENTUAN KADAR EUGENOL SECARA KROMATOGRAFI GAS

Prinsip:

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan pada distribusi zat sampel diantara dua fasa.Tujuan dari pengujian minyak atsiri menggunakan kromatografi gas ini yaitu untuk mengetahui kemurnian dari komponen-komponen minyak gagang cengkeh yang diuji secara akurat (sistem komputer).

Prosedur kerja:

1.Memasukkan sampel sebanyak 1 ml kedalam tabung

2.Meletakkan tabung tersebut pada lubang yang terdapat pada injector.

3.Mengatur variabel-variabel pengujian pada komputer.

4.Menekan tombol start pada komputer untuk memulai proses.

5.Menunggu selama 60 menit, hingga proses selesai.

6.Mengamati nilai yang tampil pada monitor.

Bagian-bagian alat kromatografi gas:

a. Gas pembawa

Gas pembawa berfungsi sebagai fasa bergerak. Umumnya helium dan nitrogen digunakan sebagai gas pembawa. Tekanan gas yang berada dalam tangki gas dengan sendirinya membantu menggerakkan gas tersebut melalui komponen-komponen kromatografi gas.

b.Sistem penyuntikan sampel (Injector)

Tujuan penyuntik sampel dalam kromatografi gas untuk memasukkan sampel ke dalam turus. Sampel disuntik melalui septum yang segera tertutup setelah jarum tersebut dicabut. Sampel yang disuntik akan masuk ke dalam liner dan dipanaskan serta hingga menguap. Sampel yang telah menguap kemudian akan digerakkan masuk ke dalam turus/kolom

c. Kolom/turus

Turus digunakan untuk memisahkan sampel dari komponen-komponennya. Turus yang digunakan untuk kromatografi gas biasanya turus kapilari dengan kebiasaannya panjang melebihi 10 meter malah ada yang mencapai 30 dan 50 meter, bergantung kepada keperluan analisis. Turus kromatografi gas dapat dibedakan berdasarkan jenis padatannya. Ada yang dari jenis polar, non polar dan intermediate. Komponen-komponen yang telah terpisah di dalam turus kapilari tersebut, akan bergerak masuk ke dalam detektor.

d. Detektor

Detektor mengukur kepekatan sesuatu komponen yang telah keluar dari turus. Detektor kemudian akan mengantarkan isyarat kepada sistem pengendalian data. Terdapat berbagai jenis detektor untuk kromatografi gas contohnya, TCD dan FID.

e. Sistem Pengendalian Data

Sistem pengendalian data berfungsi untuk menerjemahkan isyarat yang diterima dari pengesan, menjadi bentuk grafik atau data. Grafik biasanya berbentuk puncak. Data yang diperoleh biasanya tentang ketinggian puncak. Dari grafik dan data tersebut nilai-nilai seperti kepekatan sampel dan profail sampel yang dianalisis dapat diketahui. Alat perekam (chromatopac) dan komputer yang dilengkapi program penganalisis data adalah dua contoh sistem pengendalian data.

 

Hasil:

Pemrosesan ini dilakukan selama 60 menit. Setelah 60 menit, nilai kandungan eugenol yang terlihat setelah 26, 255 menit sebesar 89,23822%. Grafik hasil pengujian kromatografi gas ini terdapat pada Lampiran 7.

Pembahasan:

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan pada distribusi zat sampel diantara dua fasa. Terdapat berbagai jenis alat kromatografi, pada pengujian kromatografi ini dilakukan dengan menggunakan alat kromatografi gas. Pengujian kromatografi bertujuan untuk mengetahui kemurnian dari komponen-komponen dari minyak atsiri yang diuji. Komponen pada minyak gagang cengkeh yang paling menentukan kualitas suatu minyak cengkeh yaitu eugenol. Nilai-nilai dari komponen-komponen yang lain tidak terlalu mempengaruhi mutu. Menurut Guenther (1990), kadar eugenol pada minyak gagang cengkeh yaitu sebanyak 83 - 95%. Pada pengujian ini, didapat nilai eugenol sebesar 89,23822%. Nilai berarti telah sesuai dengan teori. Sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa minyak gagang cengkeh tersebut cukup murni. Kesimpulan:Kadar eugenol yang didapat yaitu (89,23822%). Berdasarkan standar mutu minyak gagang cengkeh dari EOA, nilai tersebut (89,23822%) telah sesuai dengan standar mutu dari EOA yaitu 89% sampai 95%.

BAB III

KESIMPULAN

           

Minyak cengkeh merupakan minyak atsiri yang diperoleh dari tanaman cengkeh Kandungan minyak cengkeh pada bagian tanaman tersebut bervariasi jumlahnya. Bunga mengandung sekitar 20% minyak, sedangkan bagian gagang dan daun sekitar 4-6% minyak Minyak atsiri dalam bunga dan gagang cengkeh mengandung eugenol dan kariofilen, yang merupakan komponen kimia yang memberikan rasa getir dan bau pedas dari cengkeh.

Eugenol merupakan persenyawaan kimia yang paling penting di dalam minyak cengkeh dan jumlahnya dapat mencapai 83-95%. Eugenol dapat diisolasi dari minyak dengan menambahkan NaOH atau KOH 3%, sehingga menghasilkan natrium atau kalium eugenolat.

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan pada distribusi zat sampel diantara dua fasa. Terdapat berbagai jenis alat kromatografi, pada pengujian kromatografi ini dilakukan dengan menggunakan alat kromatografi gas. Pengujian kromatografi bertujuan untuk mengetahui kemurnian dari komponen-komponen dari minyak atsiri yang diuji. Komponen pada minyak gagang cengkeh yang paling menentukan kualitas suatu minyak cengkeh yaitu eugenol. Nilai-nilai dari komponen-komponen yang lain tidak terlalu mempengaruhi mutu. Menurut Guenther (1990), kadar eugenol pada minyak gagang cengkeh yaitu sebanyak 83 - 95%. Pada pengujian ini, didapat nilai eugenol sebesar 89,23822%. Nilai berarti telah sesuai dengan teori. Sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa minyak gagang cengkeh tersebut cukup murni. Kesimpulan:Kadar eugenol yang didapat yaitu (89,23822%). Berdasarkan standar mutu minyak gagang cengkeh dari EOA, nilai tersebut (89,23822%) telah sesuai dengan standar mutu dari EOA yaitu 89% sampai 95%.

DAFTAR  PUSTAKA

Anonim, (2002), Cengkeh, BPPT, Download tanggal : 08 Mei 2009. http://www.iptek.net.id/obat.htm

Anonim,(2004),Eugenyl Acetate, Soul, Korea, Download tanggal : 08 Mei 2009
http://www.chemicalland21.com/arokorhi/specialtychem/perchem/eugenylacetate.htm

Anwar Chairil, dkk., (1996). Pengantar Praktikum Kimia Organik, Universitas Gajah Mada, Jakarta.

Fessenden dan Fessenden, (1999). Kimia Organik, Jilid 2, Edisi ke-3. Penerbit Erlangga, Jakarta

Guenther E., (1990), Minyak Atsiri Jilid IV A. Edisi I UI. Press Jakarta.

Oller D., (2004), Clove, Download tanggal 15 Nopember 2005 http://www.oller.net/ingredie.htm,

Sastrohamidjojo. H, (2002), Kimia Minyak Atsiri, Edisi I, Gajah Mada University Press, Yokyakarta.

Makalah Kimia Analitik

Analisis dan Aplikasi HPLC

BAB I

PENDAHULUAN

Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 10⁷ Nm^-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 μm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm³m^-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal.

Kromatografi Cair Tekanan Tinggi, HPLC merupakan bentuk kromatografi kolom yang sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan memanjang. HPLC memanfaatkan kolom yang memegang chromatographic bahan kemasan (tahap tak berubah), sebuah pompa yang bergerak selular fase (s) melalui kolom, dan detektor yang menunjukkan ingatan waktu Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung pada interaksi antara keadilan tahap, yang Molecules yang dianalisis, dan larutan (s) yang digunakan.

Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan.

Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil.

BAB II

PEMBAHASAN

2.1        ANALISIS HPLC

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif.

Penentuan Kualitatif

            HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.

Penentuan Kuantitatif

   Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:

o  Parameter percobaan sama antara standar dan sampel

o  Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

o  Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.

-          Berdasarkan area kromatogram

-          Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

 

Contoh kromatogram dengan banyak peak

 

Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh.

Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

            Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah :

A. Kolom

Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

B. Komposisi Eluen

Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.

C. Volume Injeksi

Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik), step-flow injection, dan sampling value.

D.Detektor

Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan.

Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :

o       Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel maupun fase gerak (bulk property detector).Detektor dapat dibedakan menjadi :

• Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.

• Detektor konduktivitas

• Detektor tetapan dielektrika

o       Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute property detector).Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :

1)      Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,

                  • Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)

                        Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.

Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.

• Detektor Polarografi dan radioaktif;

Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..

E. Chart Speed

            Diagram kecepatan dapat diketahui bila sampel diinjeksikan secara manual. 

2.1        APLIKASI HPLC

            Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :

1)      HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.

2)      Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

3)      Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

4)      Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

5)      Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.

6)      Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

2.1.1        Analisis Anion Nitrat (NO₃^-)

Nitrat sebagai hasil proses alami atau industri akan bisa memasuki bahan alam atau bahan industri seperti air yang sangat dibutuhkan manusia atau untuk kebutuhan industri. Kandungan dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi kualitas air tersebut. Untuk itu diperlukan suatu metode analisis yang teruji untuk mengukur kandungan nitrtat tersebut. Dengan menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dan dengan pengembangan metode dapat diketahui validitas penggunaan HPLC untuk analisis anion nitrat. Dari beberapa model pemutakhiran HPLC diketahui metode analisis HPLC dengan kolom IC Pak Anion serta eluen campuran Na-Borat glukonat : Butanol : Asetonitril (1:1:10) dan detektor Konduktivitas dapat menganalisis ion nitrat dalam air tangki reaktor, dengan batas deteksi 3,661 ppm dan sensitivitas 0,01 ppm serta uji recovery 110,41+ 1,59%.

 Validasi HPLC Untuk Analisis Anion Nitrat (NO₃^‑)

2.2.2        Analisis Vitamin C

            Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin C, yakni dalam menentukan susunan kimianya.Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933 oleh ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari USA dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk oksidasi (bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai aktivitas biologi. Dalam makanan bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat terus teroksidasi menjadi diketogulonic acid yang inaktif.

2.1.1        Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae

            Rimpang tanaman Zingiberaceae pada umumnya mengandung metabolit sekunder golongan minyak atsiri sebagai zat kandungan yang menguap dan golongan lain berupa zat yang tidak menguap dan bahkan pada beberapa Curcuma spp. dan Kaempferia spp. terdapat komponen utama yang terkristalkan dari ekstrak total yang diuapkan pelarutnya (etanol, heksan) sebagai komponen utama. Banyaknya komponen kandungan dalam rimpang dengan berbagai polaritas menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi instrumental dengan selektifitas (resolusi) yang tinggi, kromatografi cari kinerja tinggi (HPLC) untuk komponen yang termolabil, seperti dilakukan untuk stabilitas kandungan gingerol dari rimpang Jahe dan andrografolid dari Sambiloto.

Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi dibutuhkan cara eluasi gradient, dengan program menurun polaritasnya, yaitu mulai dari 10% metanol sampai metanol 100% dan pada umumnya ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan ionisasi senyawa metabolit sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti prinsip pasangan ion.

            Sampel analisis HPLC dibuat dari simplisia rimpang bentuk serbuk dimaserasi-perkolasi dengan pelarut bahan sampai diperoleh perkolat 10 kali berat bahan. Perkolat diuapkan dengan rotavapor sampai diperoleh kepekatan 1 ml ekstrak = 1 gram serbuk simplisia, diperoleh suatu ekstrak total. Sebelum ekstrak dianalisis HPLC, dilarutkan kembali dalam metanol ( 10X), kemudian dilakukan filtrasi melalui " Sepak " (SPE C18 1 X 1 cm) untuk selanjutnya diinjeksikan sejumlah 20 ul ke HPLC.

Kondisi HPLC dalam penelitian adalah sbb.: Eluasi dilakukan gradien pada kondisi awal Solvent-A (As-fosfat 0,1 N dalam aquabidestillata) : Solvent B
(Metanol pro HPLC) = 90 10; kemudian program gradien linear selamn 35 menit menuju 100% Metanol, dilanjutkan 15 menit Metanol 100%, dilanjutkan program pencucian kolom dengan 40% MetOH selama 10menit, dan diakhiri kembali kekondisi awal (10% MetOH) dalam waktu 5 menit. Kromatogram direkam selama total waktu 60 menit. Setiap kali injeksi bahan uji (ekstrak) memerlukan waktu 75 menit, kemudian dapat langsung diinjeksikan bahan uji berikutnya. Analisis HPLC dilakukan pada setiap sampel ekstrak dengan kondisi eluasi dan deteksi pada panjang gelombang 254 nm 365 nm. Analisis data : Sidik jari HPLC masing-masing ekstrak dianalisis dan dibedakan berdasarkan jumlah puncak komponen dan waktu retensinya untuk dicari karakterisasinya jika ada dalam campuran atau dalam produk.

Dari hasil pengamatan kromatogram, dapat disimpulkan bawah pada ekstrak C.domestica, C.xanthorrhiza dan C.zedoaria, jumlah puncak pada 254nm sama dengan jumlah puncak yang muncul pada 365nm juga dan jumlah puncak pada 365nm lebih besar dari pada jumlah puncak 254nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC terbaik digunakan deteksi pada 365nm. Pada ekstrak Alpinia galanga, Z.cassumunar, Z.zerumbet dan K.galanga, jumlah puncak pada 365nm sama dengan jumlah puncak yang muncul pada 254nm juga dan jumlah puncak pada 254nm lebih besar dari pada jumlah puncak 365nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC terbaik digunakan deteksi pada 254nm. C heyneana, C aeroginosa, Z offinalis, K pandurata, K angustifolia dan K rotunda jumlah puncak yang muncul sama pada 254nm dan 365nm lebih kecil dari jumlah puncak pada 254nm dan pada 365nm, sehirigga untuk pembuatan sidik jari kromatogram HPLC harus digunakan kombinasi deteksi pada 254nm clan 365nm.

2.1.2        Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis

Mutu buah-buahan segar saat ini umumnva masih dievalusi secara manual yang menggunakan tanda-tanda visual seperti warna kulit. Hasil evaluasi visual yang hanya menilai sifat fisik bagian luar ini tidak selalu mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah. Bila ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus digunakan cara kimia basah (HPLC) yang bersifat merusak. Dalam menanggulangi masalah ini perlu dilakukan suatu penelitian mengenai teknologi tertentu yang dapat dimanfaatkan untuk menentukan mutu bagian dalam buah-buahan secara tidak merusak.

Hasil penelitian tugas akhir yang telah dilakukan menunjukkan bahwa metode ultrasonik dapat dipakai untuk menentukan tingkat kematangan buah manggis secara tidak merusak. Berdasarkan basil kalibrasi 80 buah manggis, kecepatan gelombang ultrasonik yang merambat melalui buah manggis untuk tiap tingkat kematangan mempunvai nilai yang berbeda-beda. Buah manggis yang masih mentah mempunyai kecepatan gelombang ultrasonik rata-rata 337.4 m/s, untuk buah setengah matang 369.1 m/s, buah matang 397.4 mis, serta untuk buah Iewat matang mempunyai nilai kecepatan rata-rata 449.6 mis. Nilai kecepatan rata-rata gelombang ultrasonik yang merambat pada tiap tingkat kematangan buah digunakan untuk membuat suatu persamaan empiris. Persamaan ini menghubungkan tingkat kematangan terhadap kecepatan gelombang ultrasonik untuk memperkirakan tingkat kematangan berdasarkan ultrasonik. diperoleh Tk = 0.0268 V 7.9258.

Persamaan empiris yang diperoleh diuji dengan pengukuran kecepatan pada berbagai kondisi buah dengan warna visual yang beraneka ragam. Berdasarkan basil uji coba 100 buah manggis diperoleh perbedaan perkiraan kematangan antara ultrasonik dan warna kulit. Perbedaan tersebut mencapai 21%, hal ini menunjukkan bahwa warna kulit belum tentu mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah.

2.1.3        Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa Tanaman Obat

Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui antara lain melalui metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan FTIR (Fourier Trasfrorm Infrared). Penentuan kandungan senyawa aktif atau senyawa penciri dilakukan melalui proses yang panjang meliputi penghancuran bahan, pelarutan, dan pengukuran dengan HPLC dan FTIR. Proses ini memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal. Untuk itu sangat diperlukan metode yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan. Alternatif cara penentuan lain yang menyatakan hubungan antara kandungan senyawa aktif atau penciri hasil pengukuran HPLC dengan data hasil pengukuran FTIR (absorban).

Ketersediaan model ini akan menghemat waktu dan biaya. Pada tahun pertama dilakukan penentuan metode ekstraksi terbaik untuk senyawa aktif Gingerol dan Kurkumin yang berasal dari hasil pengamatan contoh petani jahe dan temulawak daerah Kulonproggo dan Karanganyar. Pada tahun pertama penyusunan model kalibrasi menggunakan dua sumber yaitu data simulasi dan data pengamatan petani jahe dan temulawak daerah Kulonprogo dan Karanganyar. Pendekatan terbaik untuk kalibrasi yang diperoleh pada tahun pertama digunakan untuk penyusunan model kalibrasi data persentase transmitan Gingerol dan Kurkumin tanaman hasil percobaan pada tahun kedua. Model kalibrasi yang diperoleh pada tahun kedua merupakan model terbaik berdasarkan data simulasi, data hasil pengamatan (Karanganyar dan Kulonprogo) serta data hasil percobaan. Pada tahun ketiga dilakukan validasi model kalibrasi yang diperoleh apda tahun sebelumnya dengan cara menerapkannya pada data konsentrasi dan persentase transmitan Gingerol dan Kurkumin yang berasal dari hasil pengamatan jahe dan temulawak yang diambil dari contoh Bogor, Cianjur, Kuningan, Majalengka dan Sukabumi.

 

BAB III

KESIMPULAN

            Kromatografi Cair Tekanan Tinggi, HPLC merupakan bentuk kromatografi kolom yang sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan memanjang. Ada dua tahap dalam analisis dengan menggunakan HPLC yaitu proses separasi/pemisahan dan identifikasi. Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kuantitatif dan penentuan kualitatif. Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah jenis kolom, komposisi eluen (jenis dan perbandingan), volume injeksi (volume sampel loop), detektor, dan chart speed (bila manual).

            HPLC memberikan peranan yang besar dalam kehidupan, antara lain: banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida ; zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair ; asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori; morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX ; dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air ; digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

Aplikasi analisis dari HPLC dalam kehidupan antara lain : analisis anion nitrat (NO₃^-), analisis vitamin C, analisis ekstrak etanol rimpang tanaman Zingiberaceae, pengukuran tingkat kematangan buah manggis, dan pendugaan kandungan senyawa bioaktif atau senyawa penciri beberapa tanaman obat.

DAFTAR  PUSTAKA

http://blogkita.info/my-kampuz/my-kuliah/kimia-analisis/dasar-analisis-vitamin-c-dengan-metode-hplc/

http://one.indoskripsi.com/node/7076.

http://labinfo.wordpress.com/2008/03/31/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-hplc/KromatografiCairKiner jaTinggi(HPLC)

http://naynienay.wordpress.com/2007/12/01/.

http://tjahkimiaunnes.blogspot.com/2009/03/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-hplc.html

http://web.ipb.ac.id/~lppm/ID/index.php?view=penelitian/hasilcari&status=buka&id_haslit=HP/005.05/NOT/p

http://www.mediafire.com/?nzqzmtojjln

Santosa, Mulya Hadi. 2008. Jurnal Perbedaan Sidik Jari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) Dengan Sistem Eluasi Gradien Diantara Berbagai Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae. Surabaya: http://www.adln.lib.unair.ac.id/go.php? id=gdlhub-gdl-res-2008-antosamul371&PHPSESSID=696b204be303b286f6d82cc4b6cb92

Setiawan, Budi. 2008. Jurnal Alidasi HPLC Untuk Analisis Anion Nitrat (NO₃^-). Yogyakarta: http://budiswan.blogspot.com/2008/11/validasi-hplc-untuk-analisis-anion.html

Situmorang. Manihar. 2009. Handout Kimia Analitik II. Medan : FMIPA UNIMED

Sudianto, Dadi. 2007. Jurnal Pengembangan Metode Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis Dengan Ultrasonik. Bandung http://tf.lib.itb.ac.id/gdl.php?mod=browse &op= read&id=jbptitbtf-gdl-s1-2007-dadisudian1798&newtheme=gray

Riyadi, Wahyu . 2008. Jurnal Identifikasi Signal Kromatogram HPLC . Bandung.: http://wahyuriyadi.blogspot.com/2009/02/identifikasi-signal-kromatogram-hplc.html.